上海農科院畜牧所成功地在一株甲醇利用慢型 (methanol utilization slow,MutS)畢赤酵母載體上克隆表達了 pIFN-α，搖瓶條件下的最高抗病毒活性達到 2.1×104IU/mL,。筆者所在課題組將智能型模式識別控制系統(tǒng)（Artificial Neural NetworkPattern Recognition based Control, ANNPR-Ctrl）運用于重組畢赤酵母的生長階段,，為高密度發(fā)酵的實現(xiàn)搭建了良好的通用平臺,；對該菌株表達目標蛋白時的最適甲醇濃度水平進行了優(yōu)化（10g/L）；采用 20℃低溫誘導策略,，使總蛋白產量提高 2~3 倍,，最高 pIFN-α抗病毒活性提高近 10 倍，并探索了 20℃低溫誘導模式下碳代謝和能量代謝的變化情況,，明確了低溫誘導可以提高能量（ATP）再生效率和發(fā)酵性能,，在 20℃低溫，5L 罐下通入富氧空氣時進行發(fā)酵,，使 DO 水平控制在≧50%的水平,，其最高抗病毒活性可達3.6×107IU/mL，目標蛋白產量可以達到 1.375g/L,。在此基礎上,，本人又進一步嘗試了山梨醇/甲醇共混流加誘導這一發(fā)酵控制策略，研究結果顯示,，共混流加誘導下的最高總蛋白濃度是 20℃低溫誘導的 3 倍,，pIFN-α 抗病毒活性是 30℃甲醇單獨誘導下最高活性的100 倍以上。
雖然低溫（20℃）誘導可以改變甲醇代謝中的代謝流分布,、加大蛋白合成支路的碳代謝通量,、提高能量（ATP）再生效率和目標蛋白的濃度。但是,，由于此時 ATP 的供給需求大幅增加,、耗氧量激增，導致規(guī)模發(fā)酵（10-100L）下的操作成本（冷卻和供氧能耗）急劇上升,。山梨醇/甲醇共混流加誘導可緩解甲醇作為唯一能源對細胞工作運轉的供能壓力和目標蛋白的降解,，同時還對醇氧化酶 AOX 具有一定程度的可逆性抑制作用、可以對甲醇代謝速率進行適度調控,。理論上,，這可以緩解低溫誘導條件下，溶氧需求過高,、溫度和溶解氧濃度（DO）難以控制的問題,。另外，山梨醇/甲醇共混流加誘導究竟是如何、通過何種途徑來提高目標蛋白（pIFN-α）的濃度或活性的,，其代謝和酶學機理尚不明確,。
圍繞以上問題，在國家重點基礎研究發(fā)展計劃 973 計劃 (No.2007CB714306) 和上海市科學委員會農業(yè)科技重點項目 (No.07391908) 的資助下,，課題組以提高pIFN-α抗病毒活性,、降低發(fā)酵成本為目標，重點探討了 10L 罐下,，山梨醇/甲醇共混流加誘導對畢赤酵母生產豬 α 干擾素產能途徑改變和發(fā)酵性能改善的影響,，為 pIFN-α 的產業(yè)化生產提供參考和借鑒。主要研究內容包括：
1） 在通用的高效發(fā)酵平臺下,，通過多批 10L 罐下畢赤酵母發(fā)酵生產 pIFN-α 的實驗，研究 30℃/20℃甲醇單獨誘導和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 pIFN-α 發(fā)酵生產性能,。采集發(fā)酵表觀參數碳源比消耗速率,、耗氧速度（OUR）、CO2,、釋放速度（CER）,、呼吸商（RQ）等，檢測發(fā)酵結果目標蛋白量,、抗病毒活性,，考察 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略在目標蛋白產量、抗病毒活性,、發(fā)酵工藝和發(fā)酵成本等多方面的優(yōu)勢,。
2） 使用通用的標準測量方法檢測不同條件下畢赤酵母誘導期關鍵產能途徑的關鍵酶活性，通過該活性數據分析不同條件下畢赤酵母的主要供能途徑,，得出 20℃甲醇單獨誘導下的主要供能途徑為甲醛異化途徑,，30℃、甲醇/山梨醇共混流加下主要供能途徑為TCA 循環(huán),，并重點分析后者在誘導期主要供能途徑如何由甲醛異化途徑轉向 TCA 循環(huán),。
3） 結合上述兩方面的數據構建 30℃/20℃甲醇單獨誘導和 30℃甲醇/山梨醇共混流加三種模式下的代謝模型，計算三種模式下的碳代謝流分配比,、理論耗氧速率和能量效率,，得到甲醇/山梨醇共混流加下走向 pIFN-α 蛋白合成的碳代謝流分配比例和能量效率明顯提高，理論耗氧速率明顯降低的結論,。為 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略的高產提供了理論依據,。
4） 通過檢測不同誘導策略下中間代謝毒副產物甲醛、甲酸的胞內積累以及畢赤酵母產能途徑關鍵物質濃度來驗證產能途徑的變化,。20℃甲醇單獨誘導條件下甲醛異化途徑的副產物甲醛,、甲酸和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 TCA 前體和關鍵物質濃度的積累量相對較高，分別對應不同條件下相對活躍的供能途徑,。
5） 研究了不同山梨醇流加速率對畢赤酵母代謝途徑的影響,。證實了文中對最優(yōu)山梨醇流加速率的選擇,。改變山梨醇流加速率會對畢赤酵母的代謝產能產生明顯的影響，應該將山梨醇流加速率控制在最佳水平,。
由于國內外關于畢赤酵母代謝模型分析的文獻報道集中于常規(guī)發(fā)酵過程,，極少有針對高效的誘導策略下發(fā)酵過程進行代謝分析。因此此次研究將對不同誘導策略下的畢赤酵母發(fā)酵過程代謝分析方法的建立起到重要的參考意義,。在發(fā)酵工藝方面,，開展10 L罐規(guī)模下畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)發(fā)酵生產pIFN-α酶學、碳代謝,、能量代謝方面的系統(tǒng)研究,，該研究的目是為形成高效和批量化的 pIFN-α發(fā)酵生產體系提供理論依據，并可為 pIFN-α 的商業(yè)生產提供一定的借鑒和參考,。
