摘要：我國多個省份的大規(guī)模養(yǎng)豬場都出現(xiàn)過新生仔豬神經(jīng)疾病和死亡的案例,，為了確定是否豬偽狂犬病病毒的感染所致，本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品,，采用PCR方法對死亡仔豬腦組織中擴(kuò)增PRV的gE基因，進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析,。將疑似PR病毒發(fā)病豬的腦部組織進(jìn)行勻漿,，提取其DNA進(jìn)行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染,。結(jié)論：依據(jù)本次實驗結(jié)果進(jìn)行推測,，當(dāng)下各個豬場流行的PRV病毒可能存在一定的抗原變異。
在現(xiàn)代臨床研究治療中,，由PR病毒所引起的豬急性傳染病就是豬偽狂犬病,，PRV病毒會導(dǎo)致不同年齡段的豬被感染，其中又以哺乳豬仔和妊娠期母豬感染最為嚴(yán)重,，致使哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹,、神經(jīng)疾病、器官衰竭直至死亡,，致使妊娠母豬流產(chǎn),、產(chǎn)木乃伊胎、死胎,，此類感染PRV病毒的死亡率達(dá)到100%,。對于PRV病毒病，我國大型養(yǎng)豬場均采用PRV基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防和治療,，大體上取得了較好的效果,。但是從2011年以來，很多采用PRV基因缺失疫苗進(jìn)行預(yù)防和治療的大型養(yǎng)豬場都出現(xiàn)了疑似PR病毒,，臨床表現(xiàn)為母豬產(chǎn)死胎,、弱仔，哺乳豬仔出現(xiàn)麻痹,、神經(jīng)疾病及死亡,。本次研究選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析，結(jié)果顯示,，這些豬場所流行的PRV病毒擁有某種程度的抗原變異,。
1 資料與方法
（1）臨床資料。選取我國多個省份的13個PR免疫豬場送檢的156份病毒樣品進(jìn)行PRV病毒的分離鑒定和血清中和實驗及gE基因序列分析,，PRV經(jīng)典強(qiáng)毒雙城株和PRV疫苗株都在本院實驗室進(jìn)行保存,。對來自我國河南、內(nèi)蒙古,、吉林,、黑龍江、江蘇等多個省區(qū)的13個PR免疫豬場送檢的懷疑是PR的豬腦組織156份病毒樣品,，選取適量豬腦組織進(jìn)行勻漿,，依據(jù)臨床操作準(zhǔn)則,，一部分勻漿液體用于病毒的分離鑒定,，一部分用于提取病毒基因組的DNA進(jìn)行PCR 鑒定,。
（2）實驗對象和細(xì)胞。實驗豬和小鼠購買自獸醫(yī)研究所,，Vero細(xì)胞在本實驗室進(jìn)行保存,。
（3）引物的設(shè)計和合成。依據(jù)GenBank中所登記的PRV基因序列分別設(shè)計用來gE全基因擴(kuò)增和序列分析的引物和擴(kuò)增部分的gE基因的檢測引物,。
（4）病毒基因組的提取和PCR擴(kuò)增以及病毒的分離,。病毒基因組的提取和PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)所描述的方法進(jìn)行臨床操作。病毒的分離是將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿,，采用過濾器進(jìn)行過濾和除菌以后,，取接種的Vero單層細(xì)胞，進(jìn)行孵化孕育1小時后,，更換含有2%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液體,，觀察細(xì)胞的病變，等待70%左右的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時收毒,，進(jìn)行凍融一次以后,，連續(xù)在Vero細(xì)胞中傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。
（5）電鏡觀察病毒粒子,。選取Vero細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液體,，采用2%的磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒的粒子形態(tài),。
（6）小鼠的感染實驗,。選取6～8周的55只小鼠，25只接種10×倍比稀釋的PRV-S強(qiáng)毒株,，25只接種10×倍比稀釋的F5代分離株,，經(jīng)過腹股溝皮下接種0.1mL，對另外5只小鼠注射等體積的DMEM培養(yǎng)液體來作為陰性對照,。觀察小鼠的臨床癥狀和死亡狀況,，依據(jù)Reed Muench方法進(jìn)行計算其LD50。
（7）病毒的中和實驗,。對新分離的病毒接種豬血清和疫苗株Bartha k61接種豬血清,，采用固定病毒稀釋血清方法測定兩株病毒的中和抗體。
2 結(jié)果
病毒資料檢測,。將疑似PR病毒的發(fā)病豬的腦部組織進(jìn)行勻漿,，提取其DNA進(jìn)行PRV檢測，發(fā)現(xiàn)各個豬場都存在病毒感染,。病毒的分離及鑒定,。將少部分豬腦腦組織勻漿液體過濾除菌接種Vero細(xì)胞，48小時可以觀察到網(wǎng)狀的細(xì)胞病變。進(jìn)行PCR鑒定,，可以擴(kuò)增到預(yù)期的大小片段,，采用豬圓環(huán)病毒、豬繁殖,、豬瘟和呼吸綜合征病毒特異性物擴(kuò)增,，都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。電鏡檢測,，觀察到病毒的粒子呈圓形,，臨床體征有實心和中心，分為沒有囊膜和有囊膜兩種,。gE基因序列的分析,。最近分離的PRV都處于相對獨立的分支中，和以往分離的病毒株親緣關(guān)系比較遠(yuǎn),。
小鼠的感染實驗,。小鼠接種的PRV-S強(qiáng)毒株和F5代分離株都出現(xiàn)了PR臨床癥狀，發(fā)病白鼠撕咬接種的部位,，致使局部皮膚出血,、皮毛脫落、撕咬肢體,，病毒接種量達(dá)到103.0～106.0的TCID50的小鼠72小時后死亡,，F(xiàn)5代分離株小鼠的LD50為103.37TCID50，PRV-S小鼠的LD50為103.83TCID50,，注射DMEM培養(yǎng)液體的對照組小鼠沒有臨床癥狀,。
血清交叉中和實驗。疫苗株Bartha k61接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平和病毒接種豬血清相比比較低,，可以50%中和自身病毒的血清稀釋度都在1∶20～1∶40,。對于分離病毒接種豬血清的中和能力更加低，分離病毒接種豬感染2周就可以產(chǎn)生高水平的中和抗體,，50%中和病毒的血清稀釋度都在1∶80以上,，對兩種病毒的中和能力都比較。
3 討論
危害養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重傳染病就包括豬偽狂犬病,，對豬偽狂犬病的預(yù)防主要依靠基因缺失疫苗的接種,。采用微量中和實驗進(jìn)行血清學(xué)進(jìn)行分析，Barthak61接種豬血清所產(chǎn)生的中和病毒接種豬血清產(chǎn)生的中和抗體水平比較低,，對新分離的病毒接種豬血清產(chǎn)生的抗體水平較高,，表明PR當(dāng)下流行的病毒株和疫苗株之間在抗原性上存在一定的差異。
（陜西省涇陽縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 屈鋒,；陜西省榆林市榆陽區(qū)青云鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站 王敏杰）
