摘要：將某雞場(chǎng)送檢的病死雞作為研究對(duì)象，分析其細(xì)菌性疾病的主要病原菌,，通過分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn),、免疫熒光抗體染色、藥敏試驗(yàn)以及PCR試驗(yàn)等步驟,，分析病原菌的形態(tài)特征,，了解其耐藥性，并將其PCR測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行對(duì)比,，對(duì)比結(jié)果表明病原菌為綠膿桿菌。

    綠膿桿菌又被稱作銅綠假單細(xì)胞菌,，能夠?qū)е露喾N動(dòng)物的臟器出現(xiàn)膿腫,，所以綠膿桿菌可以從傷口的膿液中分離獲得。各年齡段的雞都會(huì)受到綠膿桿菌的感染,，導(dǎo)致肺炎,、心肌炎以及肝周炎等疾病，死亡率高達(dá)80%,。

    1  實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)樣品選取某雞場(chǎng)送檢的4只病死雞,，對(duì)其進(jìn)行剖檢，并在無菌環(huán)境下采集病死雞的肝臟與肺臟,；實(shí)驗(yàn)采用的試劑包括瓊脂糖,、DL2000DNAMarker、10×LoadingBuffer,、腸桿菌科,、JAMES液以及快速革蘭氏染色液等；實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基包括血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等,。

    2  實(shí)驗(yàn)方法

   （1）細(xì)菌的分離培養(yǎng),。在病死雞的肝臟和肺臟中分離出細(xì)菌，通過劃線方法將其接種于麥康凱平板,、營養(yǎng)瓊脂平板以及血液瓊脂平板上,，分別將3個(gè)平板放置于37℃的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。然后選取其中的典型菌落,，分別設(shè)置為1-4號(hào),，在典型菌落純培養(yǎng)的過程中進(jìn)行革蘭氏染色,，在顯微鏡下觀察細(xì)菌。

   （2）細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn),。根據(jù)腸桿菌科相關(guān)鑒定試劑盒中帶有的說明書,，對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)中的純培養(yǎng)物進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的儀器為ATB自動(dòng)生化檢定儀,，明確雞源細(xì)菌的種屬,。

   （3）免疫熒光抗體染色。在載玻片中滴加1滴PBS,，并在培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落均勻涂布在載玻片的PBS上,，在菌落自然干燥后使用甲醇進(jìn)行15分鐘干燥；再使用PBS沖洗5分鐘,，共沖洗3次,；然后在載玻片上添加一抗，在37℃的條件下孵育30分鐘,，再使用PBS沖洗之后添加二抗,，在37℃的條件下孵育30分鐘；最后使用PBS沖洗后使用蒸餾水漂洗,，干燥后放置于熒光顯微鏡下觀察,。能夠產(chǎn)生藍(lán)綠色熒光素以及藍(lán)色綠膿素的細(xì)菌為綠膿桿菌。

   （4）藥敏試驗(yàn),。制作綠膿桿菌的肉湯培養(yǎng)物,，根據(jù)Kirby-Barer氏法，在營養(yǎng)瓊脂平板的表面均勻涂布培養(yǎng)物,。使用無菌鑷子將20種抗生素的藥敏試紙粘貼于培養(yǎng)基表面（需要注意的是,，藥敏試紙需要等距粘貼），然后將培養(yǎng)基放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí),。培養(yǎng)期間觀察并記錄試紙上的抑菌圈直徑,，按照NCCLS（2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析。

   （5）PCR試驗(yàn),。應(yīng)用細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行PCR試驗(yàn),，首先將其接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng),，然后根據(jù)樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒中帶有的說明書,，進(jìn)行分離菌株基因組DNA的提取，進(jìn)一步鑒定綠膿桿菌,。試驗(yàn)采用的上游引物序列為5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’,，下游引物序列為5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。最后根據(jù)基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，并通過1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),，明確PCR產(chǎn)物的序列,。

    3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果

   （1）細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。分離培養(yǎng)后,，營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落呈現(xiàn)出表面光滑,、邊緣參差的形態(tài)，整體呈綠色,，具有一定的芳香氣味,；麥康凱平板上的菌落呈半透明形態(tài)，整體為圓形,；血液瓊脂平板上的菌落為不規(guī)則形狀,，呈灰色，帶有溶血環(huán),。通過顯微鏡觀察,，1~4號(hào)分離菌均為革蘭氏陰性小桿菌，初步判定細(xì)菌為綠膿桿菌,。

   （2）生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。1~4號(hào)分離菌的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，都可以分解酯酶,、尿素酶以及D-葡萄糖,，可以將其鑒定為綠膿桿菌，符合率高達(dá)99.9%,。

   （3）抗體染色結(jié)果。1~4號(hào)分離菌染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)的形態(tài)為兩端鈍圓,，顏色為熒光綠色,，屬于短小桿菌，與綠膿桿菌的特征相符,。

   （4）藥敏試驗(yàn)結(jié)果,。1~4號(hào)分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相差無幾，對(duì)大觀霉素,、慶大霉素以及頭孢曲松等藥品高度敏感,，對(duì)強(qiáng)力霉素以及四環(huán)素中度敏感，對(duì)紅霉素以及頭孢噻吩等藥品不敏感,，具有一定的耐藥性,。

   （5）PCR試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)PCR試驗(yàn)獲得的序列,，將其與GenBank中公布的16株參考菌株進(jìn)行同源性比對(duì),，比對(duì)結(jié)果顯示，2號(hào)分離菌的同源性在99.7%~100%之間,，可以將其鑒定為綠膿桿菌,。

    4  結(jié)論

    綜上所述,，綠膿桿菌對(duì)于阿莫西林、頭孢噻吩以及紅霉素有較強(qiáng)的耐藥性,，對(duì)頭孢曲松,、阿米卡星以及慶大霉素等高度敏感，可以使用這類藥品進(jìn)行防治,。

   （張楊子 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所）